Анализ мутации генов муковисцидоза

Анализ мутации генов муковисцидоза

Начиная с 1960-х годов, муковисцидоз — одно из наиболее известных моногенных заболеваний человека. Это самое частое фатальное аутосомно-рецессивное генетическое заболевание детей в европеоидных популяциях, со встречаемостью приблизительно 1 на 2500 родов и частотой носительства около 1 на 25. Позиционное клонирование (см. главу 10) гена муковисцидоза (названного CFTR) в 1989 г. и выделение тремя годами ранее гена мышечной дистрофии Дюшенна стали первыми примерами возможностей молекулярно-генетических методов по идентификации генов болезней.

Вскоре после клонирования гена муковисцидоза с помощью физиологических исследований было показано, что белок, кодируемый геном CFTR, регулирует хлорный канал, располагающийся в апикальной мембране эпителиальных клеток.

Фенотипы муковисцидоза

Болезнь поражает легкие и экзокринную функцию поджелудочной железы, но главный диагностический признак — повышение концентраций хлоридов и натрия в поте (часто впервые замечаемое, когда родители целуют детей). У большинства пациентов с муковисцидозом диагноз может основываться на легочной или панкреатической симптоматике и повышении уровня хлоридов пота. Менее чем 2% пациентов имеют нормальную концентрацию хлоридов пота, несмотря на типичные клинические проявления; в этих случаях надо проводить молекулярный анализ, устанавливающий наличие мутации в гене CFTR.

Легочная патология при муковисцидозе развивается в результате избыточной секреции бронхиального секрета и повторной инфекции; первоначально ее описывают как хроническую обструктивную болезнь легких, переходящую в бронхоэктазию. Хотя интенсивное лечение легких продлевает жизнь, в конце концов, наступает смерть от инфекции и легочной недостаточности. В настоящее время около половины пациентов доживают до 33 лет при очень вариабельном клиническом течении.

Нарушения функции поджелудочной железы при муковисцидозе — синдром мальабсорбции из-за недостаточной секреции панкреатических ферментов (липазы, трипсина, химотрипсина). Нормальное пищеварение и питание в основном могут восстанавливаться при приеме ферментов поджелудочной железы. От 5 до 10% пациентов с муковисцидозом имеют некоторую остаточную функцию поджелудочной железы для нормального пищеварения и называются панкреатически достаточными.

Пациенты с муковисцидозом с достаточной функцией поджелудочной железы лучше растут и имеют более благоприятный прогноз, чем большинство больных с недостаточностью. Клиническая гетерогенность патологии поджелудочной железы, по крайней мере частично, вызвана аллельной гетерогенностью, что обсуждается далее.

У больных муковисцидозом наблюдают множество различных фенотипов. Например, у 10-20% новорожденных с муковисцидозом после рождения встречается низкая кишечная непроходимость (меконеальный илеус), наличие которой требует исключить диагноз муковисцидоза. Затрагивается также половой тракт. Хотя женщины с муковисцидозом имеют лишь незначительное снижение фертильности, более 95% мужчин с муковисцидозом бесплодны, поскольку не имеют семявыносящих протоков, фенотип, известный как врожденная двусторонняя атрезия семявыносящих протоков.

В поразительном примере аллельной гетерогенности, вызывающей частичный фенотип, было обнаружено, что некоторые бесплодные мужчины, в остальном здоровы (т.е. не имеют легочных или панкреатических проявлений), имеют врожденную двустороннюю атрезию семявыносящих протоков, сцепленную со специфическими мутантными аллелями в гене муковисцидоза. Аналогично некоторые больные идиопатическим хроническим панкреатитом имеют мутации в гене CFTR при отсутствии других клинических признаков муковисцидоза.

Ген и белок CFTR при муковисцидозе

CFTR — ген в хромосоме 7q31, ассоциированный с муковисцидозом, содержит около 190 килобаз ДНК; кодирующая область с 27 экзонами; по предсказаниям, кодирует крупный трансмембранный белок размером около 170 килодальтон. На основе предсказанной функции белок, кодируемый CFTR, назван трансмембранным регулятором проводимости муковисцидоза (англ. Cystic Fibrosis Transmembrane conductance Regulator).

Его гипотетическая структура указывала, что белок должен принадлежать к так называемому семейству транспортных белков ABC (АТФ-связанных). По крайней мере 18 транспортных белков этого семейства вовлечены в развитие менделирующих и комплексных заболеваний.

Хлорный канал CFTR имеет пять областей: две области, связанные с прикреплением к мембране, каждая с шестью трансмембранными последовательностями; две области связи с АТФ; и регуляторная область с многочисленными сайтами фосфорилирования. Значение каждой области доказано идентификацией в каждой из них вызывающих муковисцидоз миссенс-мутаций.

Отверстие хлорного канала формируется 12 трансмембранными сегментами. АТФ связывается и гидролизуется в нуклеотидной области, полученная энергия используется для открывания и закрывания канала. Управление канала связано, по крайней мере частично, с фосфорилированием регуляторного домена.

Патофизиология муковисцидоза

Муковисцидоз — следствие аномального транспорта жидкостей и электролитов через апикальные мембраны эпителия. Эта аномалия приводит к патологии легких, поджелудочной железы, кишечника, гепатобилиарного дерева и мужского полового тракта. Патофизиологические аномалии наиболее хорошо объяснены для потовых желез.

Снижение функции CFTR означает, что хлориды не могут реабсорироваться в канале потовых желез, приводя к уменьшению электрохимического градиента, в норме управляющего движением натрия через апикальную мембрану. Этот дефект, в свою очередь, ведет к повышению концентрации хлоридов и натрия в поте. Влияние на транспорт электролитов аномалий в белке CFTR также тщательно изучено в дыхательных путях и эпителии поджелудочной железы.

В легких повышенное поглощение натрия и сниженная секреция хлоридов приводят к уменьшению поверхностной жидкости дыхательных путей. Следовательно, слой слизи может прилипать к поверхности клеток, нарушая откашливание и отхождение слизи, обеспечивая благоприятные условия для синегнойной палочки (Pseudomonas aeruginosa), основного возбудителя хронической легочной инфекции при муковисцидозе.

Генетика муковисцидоза

Мутации в полипептиде CFTR при муковисцидозе. Первая идентифицированная мутация при муковисцидозе, делеция остатка фенилаланина в позиции 508 (F508), в первой области, связывающей АТФ (NBD1), — самый частый дефект, составляющий до 70% всех аллелей муковисцидоза в европеоидных популяциях. В этих популяциях только семь других мутаций встречаются с частотой выше 0,5%. Описаны все типы мутаций, но наибольшая группа (почти половина) — миссенс-замены.

Остальные представляют точковые мутации других типов, менее 1% — геномные перегруппировки. Хотя выявлено более 1200 связанных с болезнью вариантов последовательности гена муковисцидоза, фактическое количество патогенных миссенс-мутаций отчасти остается неопределенным, поскольку не все подвергнуты функциональному анализу.

Хотя биохимические аномалии, связываемые с большинством мутаций при муковисцидозе, неизвестны, описаны четыре общих механизма нарушения белковой функции. Мутации 1-го класса вызывают нарушения в синтезе белка, например связанные с преждевременными стоп-кодонами или мутациями, приводящими к нестабильности РНК. Поскольку CFTR — гликозилированный трансмембранный белок, он должен обрабатываться и гликозилироваться в эндоплазматическом ретикулуме и комплексе Гольджи; мутации 2-го класса — результат дефекта белка, вызывающего нарушение его третичной структуры.

Этот класс иллюстрирует мутация F508, мутантный белок нормально не складывается и не может выйти из эндоплазматического ретикулума. Тем не менее фенотип белка F508 комплексный: кроме нарушения складывания, белок также имеет дефекты в устойчивости и активизации.

Существенные функции нуклеотид-сцепленных областей и регуляторной области иллюстрируются случаем вызывающих муковисцидоз мутаций, нарушающих регулирование белка (мутации 3-го класса). Мутации 4-го класса располагаются в мембранной области и, соответственно этой локализации, приводят к нарушению проведения хлоридов. Мутации 5-го класса уменьшают число копий CFTR. Мутантные белки класса 6 синтезируются нормально, но неустойчивы на поверхности клетки.

Генокопирование при муковисцидозе: мутации в гене эпителиального натриевого канала SCNN1

Хотя CFTR — единственный ген, сцепленный с классическим муковисцидозом, обнаружено несколько семей с неклассическими проявлениями (включая муковисцидоз-подобные легочные инфекции с менее тяжелыми нарушениями пищеварения и повышением уровня хлоридов пота), имеющих мутации в гене эпителиального натриевого канала SCNN1.

Это соответствует функциональному взаимодействию белка CFTR и эпителиального канала натрия. Основное его клиническое значение в настоящее время — демонстрация того, что пациенты с неклассическим муковисцидозом могут иметь локусную гетерогенность, и если мутации в гене CFTR не обнаружены, нужно искать аномалии в гене SCNN1.

Корреляции генотипа и фенотипа при муковисцидозе. Поскольку все пациенты с классической формой муковисцидоза имеют мутации в гене муковисцидоза, клиническая гетерогенность при муковисцидозе обусловлена аллельной гетерогенностью, эффектами других модифицирующих локусов или негенетических факторов. Из генетического и клинического анализа пациентов с муковисцидозом возникли два обобщения.

Во-первых, генотип CFTR дает возможность точного прогноза экзокринной функции поджелудочной железы. Например, пациенты, гомозиготные по частой мутации F508 или другим аллелям с нарушенным синтезом белка (например, преждевременным стоп-кодонам), обычно имеют недостаточность поджелудочной железы. С другой стороны, аллели, допускающие синтез частично функционального белка CFTR, например Argll7His, обычно имеют достаточную функцию поджелудочной железы. Во-вторых, генотип CFTR не дает оснований для прогнозирования тяжести патологии легких.

Например, тяжесть патологии легких варьирует среди гомозиготных по мутации F508 пациентов. Причины такой слабой корреляции генотипа и фенотипа для патологии легких непонятны. Недавно было сообщение о выявлении гена-модификатора патологии легких при муковисцидозе, гене, кодирующем TGFbl. Два варианта TGFbl ассоциируются с более тяжелой патологией легких при муковисцидозе. Если данный факт окажется достоверным, это может обеспечить понимание патологических механизмов, лежащих в основе патологии легких и расширить терапевтические возможности.

Использованные источники: meduniver.com

СТАТЬИ ПО ТЕМЕ:

  Несахарный диабет в моче

  К чему приводит гипогликемия

Генетическая диагностика муковисцидоза. Анализ гена CFTR (25 мутаций)

Комплексное генетическое исследование, которое позволяет выявить 25 наиболее часто встречающихся на территории России мутаций гена CFTR, приводящих к развитию тяжелого наследственного заболевания муковисцидоза.

Какой биоматериал можно использовать для исследования?

Венозную кровь, буккальный (щечный) эпителий.

Как правильно подготовиться к исследованию?

Специальной подготовки не требуется.

Общая информация об исследовании

Муковисцидоз (синоним – кистозный фиброз) – одно из наиболее распространенных аутосомно-рецессивных наследственных заболеваний человека. Он характеризуется нарушением функции эпителия дыхательных путей, кишечника, поджелудочной железы, потовых и половых желез.

Причиной развития муковисцидоза являются мутации в гене CFTR (cystic fibrosis transmembrane regulator), кодирующем АТФ-связывающий белок, который формирует канал для ионов хлора в клеточных стенках. Мутации приводят к нарушению транспорта электролитов и ионов хлора через мембраны эпителиальных клеток, что сопровождается усилением секреции густой слизи и закупоркой выводящих протоков различных желез.

Существует несколько форм муковисцидоза:

  • смешанная (поражаются одновременно органы дыхания и пищеварительный тракт);
  • бронхолегочная (поражаются преимущественно органы дыхания);
  • кишечная (поражается преимущественно желудочно-кишечный тракт);
  • мекониевая непроходимость кишечника;
  • атипичные формы, связанные с изолированными поражениями отдельных желез внешней секреции.

В настоящее время в РФ диагноз «муковисцидоз» ставится одному из 9 000 новорожденных (для сравнения: в Европе муковисцидоз диагностируется с частотой 1 : 2 000 — 3 000 новорожденных). Однако принятая в России форма массового скрининга новорожденных несовершенна и иногда не позволяет выявить заболевание на доклинической стадии.

В каждой клетке нашего организма имеется две копии гена CFTR. Одна копия достается от отца, а вторая от матери. Заболевание муковисцидоз аутосомно-рецессивное, т. е. развивается оно только при условии, что ребенок получает и от отца, и от матери мутантный ген CFTR. При этом родители, у которых вторые копии гена CFTR нормальные, не страдают муковисцидозом и порой даже не догадываются о его носительстве. По статистике, в европейской популяции носителем мутаций гена CFTR в среднем является каждый 25-й человек.

Насчитывается примерно одна тысяча различных мутаций в гене CFTR. Они встречаются с различной частотой в разных популяциях. Некоторые нарушения в гене могут не иметь никаких проявлений. Но большая часть мутаций вызывает патологический эффект, т. к. приводит к нарушению функционирования белка.

В данное комплексное исследование включен анализ гена CFTR на 25 мутаций, наиболее распространенных на территории РФ, Восточной Европы и Скандинавии и связанных с развитием тяжелых клинических форм муковисцидоза. Исследование позволяет выявлять до 95 % всех возможных больных, что существенно превышает разрешающие способности утвержденного в России скрининга.

Исследование поможет не только подтвердить или опровергнуть диагноз «муковисцидоз», но и выявить носительство мутации у здоровых людей. Особенно важно проводить генетическое тестирование в семьях, в которых есть больные муковисцидозом, поскольку у пары, где оба родителя являются носителями мутаций, вероятность рождения больного ребенка составляет 25 %.

До сих пор муковисцидоз считается неизлечимым заболеванием, но ранняя диагностика и адекватная терапия значительно улучшают прогноз заболевания и продляют пациенту жизнь.

Перечень исследуемых мутаций в гене CFTR:

Использованные источники: helix.ru

СМОТРИТЕ ЕЩЕ:

  Несахарный диабет в моче

  Похудел и гинекомастия прошла

Муковисцидоз — мутации гена CFTR (CYSTIC FIBROSIS — CYSTIC FIBROSIS TRANSMEMBRANE CONDUCTANCE REGULATOR gene)

Данный анализ предназначен для выявления мутаций, связанных с одним из наиболее частых моногенных заболеваний — муковисцидозом. Исследование мутаций гена CFTR может иметь диагностическое значение (у больных с клиническими проявлениями заболевания), а также прогностическое значение с целью выявления носительства неблагоприятных мутаций у здоровых лиц, вступающих в брак и/или планирующих деторождение. Кроме того, исследование на наличие мутаций в гене CFTR проводят при мужском бесплодии (отсутствие или непроходимость семявыносящих путей).

ГЕН ВХОДИТ В СОСТАВ ИССЛЕДОВАНИЙ:

Выделяют несколько клинических форм муковисцидоза. Лёгочная форма характеризуется преимущественным поражением бронхолёгочной системы в виде упорного, нередко приступообразного, кашля с трудно отделяемой вязкой мокротой, нарастающей одышкой при отсутствии признаков пневмонии. Впоследствии развиваются обструктивный, затем гнойный бронхит, рецидивирующие пневмонии, эмфизема лёгких, ателектазы, бронхоэктазы, сопровождающиеся дыхательной недостаточностью. Кишечная форма — проявляется плохой прибавкой массы тела при хорошем уходе и нормальном, а чаще повышенном аппетите, вздутием и увеличением размеров живота, снижением мышечного тонуса и тургора тканей. Учащается стул, развивается полифекалия (большой объём каловых масс) с резко зловонным, блестящим, светло-серым калом; иногда нерасщеплённый жир вытекает из заднего прохода в виде маслянистой жидкости, оставляющей на пеленках жирные пятна. У некоторых больных отмечается склонность к запорам, при этом кал светлый, жирный и либо остается жидким и зловонным, либо становится оформленным, плотным, иногда напоминающим «овечий». Дети могут отставать в росте, у большинства больных отмечаются боли в животе, в ряде случаев наблюдается выпадение прямой кишки. Сохранённый в начале болезни аппетит по мере её развития снижается. Следствием длительного нарушения процессов пищеварения становятся тяжелая дистрофия, полигиповитаминоз, обменные расстройства.

Изменения печени при муковисцидозе характеризуются застоем желчи и механической желтухой, чаще проявляющихся в периоде новорождённости. Через месяцы или годы развивается портальная гипертензия (повышения давления в системе полой вены) с увеличением селезёнки и иногда с явлениями асцита (скопление жидкости в брюшной полости). У детей с муковисцидозом повышается риск развития желчнокаменной болезни.

Мутации CFTR гена являются наиболее частой причиной мужского бесплодия, связанного с врожденным двух- или односторонним нарушением проходимости или отсутствием семявыносящих протоков. Отсутствие семявыносящих протоков наблюдается у 2% бесплодных мужчин и 6% страдающих обструктивной азооспермией. В настоящее время известно, что частота носительства для отдельных мутаций муковисцидоза у бесплодных мужчин значительно выше (12%), чем частота носительства тех же мутаций в обычной популяции (3%). Отличительными особенностями спермограмм мужчин, имеющих различные мягкие мутации гена муковисцидоза, являются олигоастенотератозооспермия, изолированная олигозооспермия, азооспермия неясного генеза, сниженный объём семенной плазмы, отсутствие или низкая концентрация фруктозы, патологическая вязкость эякулята. Также с нарушением фертильности у мужчин связывают вариант 5Т полиморфизма ТТ в 8-м интроне гена CFTR.

Прогноз при муковисцидозе серьёзный и зависит от формы и тяжести течения заболевания, возраста, в котором появились первые симптомы, ранней диагностики и целенаправленного лечения. Средняя продолжительность жизни — 25 лет. Некоторые больные с муковисцидозом живут более 50-60 лет. Большинство больных погибает от дыхательной недостаточности (95%). Вследствие врождённой облитерации семенных протоков практически все мужчины, страдающие муковисцидозом, стерильны. У женщин, страдающих муковисцидозом, происходит образование густого спермицидного шеечного секрета, что уменьшает вероятность оплодотворения.

Профилактика муковисцидоза заключается в проведении медико-генетического консультирования семей, где имеются больные муковисцидозом. Для постановки клинического диагноза муковисцидоза используют определение электролитов в потовой жидкости после стимуляции альдостероном (содержание солей повышено).

Ген CFTR кодирует аминокислотную последовательность молекулы трансмембранного регуляторного белка муковисцидоза (cystic fibrosis transmembrane conductance regulator), относящегося к семейству так называемых ABC транспортеров (от ATP-binding cassette). Белок CFTR представляет собой цАМФ-активируемый Cl- канал клеточной мембраны, который обеспечивает транспорт хлора и других ионов. Ген CFTR экспрессируется в различных тканях (почки, поджелудочная железа, кишечник, сердце, семявыносящие протоки, легкие, протоки потовых желез и др.). За счет CFTR обеспечивается процесс секреции различных жидких продуктов. Мутации в гене CFTR приводят к нарушению процесса секреции, вследствие чего секреты желез становятся вязкими, и их выделение затрудняется. В результате развиваются воспалительные процессы в различных органах — легких, поджелудочной железе и др., приводя к формированию характерной для муковисцидоза клиники.

Основные мутации в гене CFTR — del21kb, delF508, delI507, 1677delTA, 2143delT, 2184insA, 394delTT, 3821delT, G542X, W1282X, N1303K, L138ins, R334W, 3849+10kbC>T обусловливают примерно 75% генетических дефектов, приводящих к муковисцидозу. Из этих мутаций наиболее частой является делеция del F508. Частота ее в России составляет около 55%. Всего же в гене CFTR описано свыше 700 мутаций, большинство из которых являются очень редкими. Тип наследования муковисцидоза — аутосомно-рецессивный. При диагностике генетических причин мужского бесплодия в гене CFTR также определяется количество ТТ-повторов в 8-м интроне (ТТ-полиморфизм). В норме количество ТТ-повторов равно 7 (вариант 7Т) или 9 (вариант 9Т).

  • Материал для исследования: цельная кровь (2 — 3 мл), взятая с ЭДТА.
  • Метод определения: ПЦР и рестрикционный анализ.

Литература:

  1. Геномика — медицине. Научное издание / Под ред.академика РАМН В.И.Иванова и академика РАН Л.Л.Киселева.- М.: Академкнига, 2005.- 392 с.
  2. База OMIM *219700 www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/dispomim.cgi?id=219700

Смотрите также:

  1. Клинический диагноз муковисцидоза.
  2. Супружеские пары, планирующие деторождение (в том числе имеющие здорового ребёнка).
  3. Супружеские пары, имеющие ребёнка с муковисцидозом.
  4. Супружеские пары, являющиеся кровными родственниками.
  5. Родственники больных муковисцидозом.

Варианты заключений:
мутации не обнаружены;
мутации обнаружены (указывается какие и в какой форме)

Частота встречаемости заболевания – 1:5000 новорождённых.
Частота гетерозиготного носительства мутаций в гене CFTR – 1:30 человек.

Использованные источники: www.invitro.ru

Related Post